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293细胞培养特性与培养基选择

摘要 : 293细胞明显适应酸性环境,pH值在6.9~7.1时,可顺利贴壁生长, 换液时动作要轻。一般用高糖的DMEM培养基。

1.培养基DMEM ++丙酮酸钠++10%血清++青链霉素

2.复苏:

(1)37度融化后,擦干冻存管 酒精擦,细胞加入15ml离心管,加5ml培养基,500g离心5min,弃上清,加1ml培养基重悬后加入到培养瓶中,5~6ml左右,记得晃匀。

3. 传代 吸出旧培基,加5mlPBS洗1-2遍,用移液管加1ml胰酶,滚2遍吸出,37度放1min左右计时,看到变圆即加入新培基吹打 ,几下就好了,分到新瓶里。

我个人认为:293细胞贴壁后形成圆形,可能是细胞本身状态不是很好,细胞不够饱满,细胞的贴壁后的棱角不易显露出来,所以看上去类似圆形,而且细胞较小。

293细胞是用5型腺病毒75株系转化,含有Ad5 E1区的人胚肾亚三倍体细胞系,是一种E1区缺陷互补细胞系。它是加拿大McMaster University的F.L.Graham与J.S.Miley于1976年用DNA转染技术构建而成。293细胞是贴壁依赖型呈上皮样细胞,表现出典型的腺病毒转化细胞的表型,细胞允许Ad5和其他血清型腺病毒在其上增殖。哺乳细胞的大规模培养方式有三种:贴壁培养、微载体培养、无血清悬浮培养。这三种方式均可用于293细胞的大规模培养。293细胞在无Ca2+或含Ca2+培养基中可同样生长,也可生长在血清浓度降低的培养基中。单层培养细胞在5-10%FBS-DMEM中能生长很好。一般来讲,1:10传代后,一周可以长满。严禁过度生长,这点很重要。因为会导致细胞密度加大和堆积,影响病毒斑的形成和转染,传代时也不易打散。悬浮的293细胞很容易大规模培养,但不容易长期保持稳定。293细胞在传代120次以后,其表型可能改变,生长状况不再完全是单层的了,偶尔会形成局部的细胞成团聚集,应立即抛弃,重新引入新传代的细胞。

293细胞培养特性:

1、293细胞明显适应酸性环境,pH值在6.9~7.1时,可顺利贴壁生长, 换液时动作要轻。一般用高糖的dmem培养基

2、传代:倒去废液,PBS洗一次(轻),用0.02%EDTA与0.25%Trypsin消化,生长良好细胞,培养瓶中轻摇,使之流遍所有细胞表面,即将其吸除或弃去消化30s,然后吸去,再让剩下的EDTA/Trypsin作用30s,镜下观察细胞变圆,就可加DMEM终止消化,反复吹打至细胞全成单个悬浮细胞即可。12小时-24小时90%以上细胞贴壁。293细胞传代时机为达80-90%汇合,传代比例为1:3。

3、293细胞在低代时容易贴壁,生长良好,在传到几十代以后,易聚集成团,且贴壁不牢,用PBS冲洗时即可能脱落,即使消化后也不容易吹打成单细胞悬液,最好购入时先大量冻存。

4、复苏 293细胞的另一生长特性是贴壁所需时间长且贴壁不牢。细胞冷冻后复苏时,都有不同程度的肿胀,若以50ml培养瓶待细胞长满瓶底的70%~80%时消化冻存,复苏时将其全部接种至2个50ml瓶中时较为合适。刚复苏的293贴壁很慢,复苏接种后24小时内,应尽量减少观察细胞次数或不作观察,以免因晃动而影响细胞贴壁。复苏后48小时左右观察贴壁情况并进行首次更换培养基比较合适,如果用一次性塑料培养瓶可增加细胞贴壁牢度。换液前宜将培养基预热。

5、转染:体外应用293细胞进行细胞转染时,如果是采用磷酸钙转染,一定要注意293细胞不要全部长满细胞培养盘,长满细胞时加入磷酸钙就会使293细胞大片的脱落,最好是当293生长到1/2或2/3时进行磷酸钙转染,可以避免细胞的大量脱落。

其它的经验:1、用大瓶培养较小瓶要好,可能是更有利于293均匀的分布,利于营养的摄取

2、培养液要新鲜,每次只配1000ml,分为2-4瓶,不用的培养液,冻存在-20度,

3、要及时传代,最好是细胞基本铺满培养瓶底部,但是细胞之间还没有完全贴紧,总是多少有空隙的时候最好。

4、如果细胞贴壁不好,可能是消化过久,或是培养瓶不够干净,当然要除外细胞污染。

5、如果使用用玻璃培养瓶或皿,可以采用高压灭菌的0.2%明胶溶液预处理培养瓶/培养皿,方法是将明胶加入培养皿,使之浸泡到底面的各个部分,然后吸出,置超净台内晾干即可使用。这样处理后细胞贴壁效果好且镜下细胞立体感强。如果是新的塑料培养瓶就不用处理。

培养基;GIBCO DMEM粉剂,加双抗,HEPES,NaHCO3

配置高糖的DMEM培养基1000ml,

1.一袋DMEM培养基(GIBCOBRL)用去离子水溶解

2.加入NaHCO3 2.0g

3.加入谷氨酰胺 0.146g(终浓度为5mM)

4.加入青霉素10万U(终浓度100u/ml),链霉素6.5万U(终浓度100u/ml)

5.定容900ml

6.过滤除菌、分装到两个消毒的500ml瓶子中

7.加入灭活小牛血清100ml。

L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。

脱掉氨基后,L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解,但是确切的降解率一直没有最终确定。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成,而氨对于一些细胞具有毒性。

五、谷氨酰胺补充液:谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用,合成培养基中都要添加,由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定容易降解,4℃下放置7天即可分解约50%,所以都是在使用前添加。配制好的培养液(含谷氨酰胺)在4℃放置2周以上时,要重新加入原来量的谷氨酰胺,故需单独配制谷氨酰胺,以便临时加入培养液内。谷氨酰胺使用终浓度为0.002mol/L。一般配制为100倍浓缩液,即浓度为200mmol/L(29.22g/L),配制时应加温30℃,完全溶解后过滤除菌,分装至小瓶,储存于-20℃。使用时,在每100ml培养液中加入0.5~2ml谷氨酰胺浓缩液,终浓度为1~4mmol/L。

DMEMF11培养液――取15.6 g DMEMF11溶于700~800 mL超声水中,加入3.7 g NaHCO3,用1 mol/L HCI或1 tool/L NaOH调节pH值至7.0~7.2,加超声水定容至1 000 mL,0.22 p,m滤膜过滤,根据需要加入5% ~10%胎牛血清。

柠檬酸盐细胞消化液――50 g KCI、22 g柠檬酸钠加超纯水至500 mL即为10×柠檬酸盐细胞消化液,高压蒸气消毒(1.034×lo5 Pa)15 min后4℃冰箱贮存。临用前以无菌超纯水稀释l0倍即为1×柠檬酸盐细胞消化液。

低代次293细胞培养基的配制DMEMF11 90 mL加FBS 10 mL,再加入青霉素和链霉素终浓度为100 U/mL。即为10%FBS的293细胞培养基。

细胞的复苏 快速取出冻存的低代次293细胞,将其安剖的底端1/2浸于37℃水浴中,轻轻晃动以加速融解。在超净工作台中,以70% 乙醇对细胞安剖表面消毒,将细胞转移至75 cm 的细胞培养瓶中,加入10 mL低代次293细胞培养基置于细胞培养箱内培养。6~8 h后待细胞贴壁更换培养基。这与传统的方法——离心洗涤后再转人培养箱内培养不同。

细胞的传代 待细胞的融合度至90% ,以1:2的比率传代。首先吸出培养基,然后加入1×柠檬酸盐细胞消化液3~5 mL洗2遍,留取0.5 mL 37℃消化5~10 min。将培养瓶在桌面轻轻敲打使细胞脱壁、漂浮、分散,为使细胞进一步分散可轻轻吹打几次。然后加入培养基3 mL,温和混匀,分别取1.5 mL细胞悬浮液加入2个25 cm 培养瓶中,再加入2 mL低代次293细胞培养基置于细胞培养箱内继续培养。

细胞的冻存 待细胞融合度至90%左右,吸出培养基以1×柠檬酸盐细胞消化液消化分散细胞,方法同细胞传代。加入5 mL培养基中和消化液,200×g离心5 rain收集细胞沉淀,再以1 mL细胞冻存液(90%FBS+10%DMSO)重悬,一70℃或液氮中冻存。

文献报道,该细胞在培养过程中不容易贴壁,生长活力低,易造成损伤,而且随着传代次数的增加包装病毒的生物学特性会丢失。在培养过程中为减轻细胞损伤,可:

(1)利用低代次293细胞贴壁的特性,在复苏和传代时不离心,而是加入10 mL培养基中和细胞消化液,培养6~8 h,细胞贴壁后更换新鲜培养基,从而避免了离心剪切力对细胞造成的机械损伤;

(2)在消化细胞时,振荡培养瓶,避免直接反复剧烈吹打细胞。细胞形态观察、贴壁率和生长曲线表明,这种方法对细胞损伤小,能维持细胞较好的生长状态。

NG等研究表明,低代次293细胞在培养过程中传代时融合度过高或过低,其整合的腺病毒El区基因易丢失;另外,不适当的传代比率也会导致细胞生物学特性发生改变。为此,笔者把细胞传代的融合度控制在90%左右,传代比率l:o以腺病毒感染质粒pFG140感染传l0代以后的低代次293细胞,可成功包装出腺病毒,表明这种传代方法可较好保持细胞的生物学特性。

本人也做过一段时间的293细胞培养,当时是用来扩增腺病毒的。看了楼主的描述,我觉得不贴壁与你3小时后的扰动关系不大。我倒是觉得你种细胞的浓度太 大。为什么要将15瓶的细胞收集起来再分别种于8个培养皿呢?浓度太大了。要知道293长到一定程度(>80%)的时候细胞的特性会发生变化。我一 般是将一瓶细胞悬浮,分别种于于2-3个培养皿中,然后让其生长到80-90%满,加入病毒原液。等到所有细胞变圆飘起就说明扩增过程完成了。这样培养 293在转染前的状态是最好的,对病毒扩增最有利!不像你的方法,一下种那么密,就算都能贴壁,那时的细胞密度已经接近80-90%,况且细胞都是才传代 的,状态肯定没有稀释培养法好。另外,给你个重要的提示:293细胞很容易吹打下来。不需要使用胰酶,反复吹打即可。长到80%的细胞更容易吹下来!胰酶 对293细胞的伤害很大,即使你的消化时间很短。希望对你有用。

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