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细胞培养基使用方法(微孔滤膜过滤除菌)

摘要 : 细胞培养基的种类繁多,细胞培养方式也较多,如何正确地使用培养基及最大程度地保持培养基的营养以维持细胞的生长,对每个细胞培养工作者都很重要。培养基的使用依据不同的培养基种类、培养方式、细胞种类的不同而存在差异。

细胞培养基的种类繁多,细胞培养方式也较多,如何正确地使用培养基及最大程度地保持培养基的营养以维持细胞的生长,对每个细胞培养工作者都很重要。培养基的使用依据不同的培养基种类、培养方式、细胞种类的不同而存在差异。

1、细胞培养液的构成

细胞培养液指细胞生长的液体环境,一般指完全培养液,添加了血清、水解乳蛋白、各种添加剂等可以直接使用的培养液。

1.1 细胞培养基&血清模式

血清对于在传统培养基配方中生长和增殖的大多数细胞系来说是需要的,因为大多数单独的培养基并不能提供细胞生长所需要的全部营养,如MEM培养基,较为常用的量为5%~10%的比例,而特殊的低血清培养基血清量可降至3%左右,细胞的形态和功能不受影响。

细胞培养基使用方法(微孔滤膜过滤除菌)
细胞培养基使用方法(微孔滤膜过滤除菌)

图1 BHK21-13第14代,mem SLM培养基(SLM120)+3%NBS,100×

注:SLM120为清大天一公司低血清培养基,上图为培养24小时细胞密度,下图为48小时细胞密度。

血清可在培养基灭菌后加入,也可与培养基混合后一起过滤。血清的添加一方面补充了细胞生长、增殖所需的一些因子(如生长因子等),另一方面也增加了培养基的黏滞度,这样可以降低细胞在悬浮培养中或被胰蛋白酶消化后的损伤。

但是血清的加入也带来了很多问题,血清都是批量生产,各批之间差异很大,血清含一些对细胞产生毒性的物质,如多胺氧化酶、补体、抗体、细菌毒素等都会影响细胞生长,甚至造成细胞死亡。血清的使用使得实验和生产的标准化困难,其中的蛋白质使得某些转基因蛋白生物药品生产中分离纯化工作很难完成。血清质量问题还会对接种病毒以及毒价产生影响,例产毒少,毒价低。

1.2 细胞培养基&乳欧液模式

化学合成培养基现虽已大规模使用,但在某些培养领域水解乳蛋白(Lactalbumin Hydrolysate )仍在使用,以补充培养液中缺乏的氨基酸、小肽物质。较为常用的方式是用汉氏(Hank's BSS)或欧式(Earle's BSS)平衡盐溶液溶解水解乳蛋白(一般为5‰浓度),即成乳汉(欧)液,再与化学合成培养基(一般为MEM)按比例混合使用(如1:1)。

水解乳蛋白为乳白蛋白经蛋白酶和肽酶水解的产物,含有丰富的氨基酸。既可用于细菌微生物培养,又可用于动物细胞培养。细胞培养中一般为0.5%水解乳蛋白(经平衡盐溶解)与合成培养基(如MEM)按1:1混合使用。目前在生产中主要用于地鼠肾细胞等细胞的培养和维持。但是水解乳蛋白的使用也给生物制品的生产带来一定的风险。首先由于水解乳蛋白来源于动物,有可能携带传染源,包括病毒和有毒物质。任何一种传染源都可能对正在生长的细胞系或者制品带来风险。其次水解乳蛋白及含有动物组分培养基的使用,使生物制品下游处理变得复杂,这对于蛋白质药物显得更加重要。因为用动物细胞生产生物药品,其面临的最大困难就是如何去除内源或同源蛋白。不确定的成分,例如动物肽类物质的引入,势必会增加提取、分离、纯化步骤,一方面使成本提高,另一方面也会影响生物制品的产量和质量。

1.3 细胞培养基&各类添加剂(生长因子等)模式

成分复杂的培养基还含有许多化合物,包括蛋白质、多肽、核苷、柠檬酸循环的中间产物、丙酮酸及脂类等。已发现当培养基中的血清浓度减少时,这些成分都是必需的。既使在使用血清的情况下,这些成分也可帮助细胞的克隆化培养及维持某些特殊细胞系的生长。

激素和生长因子在大多数常规培养基的配方中都没有注明,但在无血清培养基中通常要加入它们,用其来代替血清中的激素(包括50ng/ml的生长激素和1~10U/ml的胰岛素),它们能增加多种不同类型细胞的贴瓶率;氢化可的松能提高胶质细胞、成纤维细胞的克隆形成率。生长因子包括FGF家族、EGF、PDGF、IGF-1和IGF-2及白介素等,生长因子和细胞因子有着广泛的特异性,一般与激素或其它物质起相互协同或加成作用。

另一种常见的添加物就是血清替代物,目前已有许多可完全或部分替代传统培养液中血清成分的商业产品,其稳定性较好,但批次间仍有差别,产品的成分也不很确定。

2、细胞培养基配制

2.1 干粉培养基原倍液的配制

1)配制过滤除菌的细胞培养基

1)阅读培养基使用说明,确定需要添加何种添加剂(如NaHCO3、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等)。

2)根据所需将培养基全部倒入一容器中,用少量注射用水(20℃~30℃)将袋内残留培养基洗下,并入容器。加注射用水至总体积的95%,轻微搅拌溶解。

3)加入规定量的碳酸氢钠及所要添加的物质。

4)轻微搅拌溶解,加注射用水至规定体积。

5)用1mol/L 氢氧化钠溶液或1mol/L盐酸溶液调pH至所需值。

6)用0.22μm滤膜正压过滤除菌。

7)溶液应在2℃~8℃下避光保存。

具体使用方法参照培养基包装袋上的说明书。

(2) 配制可高压灭菌细胞培养基

1)根据所需将培养基全部倒入一容器中,用少量注射用水(20℃~30℃)将袋内残留培养基洗下,并入容器。加注射用水至总体积的95%,轻微搅拌溶解。

2) 在121℃、15psi下灭菌15分钟。

3) 待溶液冷却至室温,加入无菌0.2mol/L L-谷氨酰胺溶液规定体积、无菌7.5%(w/v)碳酸氢钠溶液规定体积,加注射用水(20℃~30℃)至规定体积,混匀。

4) 如果必要,用1mol/L 氢氧化钠溶液或1mol / L盐酸溶液调pH至所需值。

5) 溶液应在2℃~8℃下避光保存。

具体使用方法参照培养基包装袋上的说明书。

3 注意事项

(1) 细胞培养用水一般为三蒸水(经石英蒸馏器蒸馏)或超纯水,医药生产上一般为注射用水。

(2) 建议尽量选择与所用量相匹配的包装一次使用,因为包装一旦打开,组分可能会变质或因受潮而结团。

(3) 溶解干粉培养基时先加入终体积90%~95%的培养用水,添加剂加完后再补足。

(4) 如需添加的组分较多时,某一组分完全溶解后,再添加另一组分。

(5) 待培养基完全溶解后再加入碳酸氢钠,以免产生沉淀。

(6) 所有成分完全溶解后,培养基应立即过滤或高压除菌,以免产生沉淀或有微生物污染。

(7) 由于除菌过滤后,pH值可能会升高0.1~0.2个单位,因此在过滤前,可将pH调至比所需值低0.1~0.2个单位。

(8) 在细胞培养过程中,建议不加或加少量的抗生素,如血清的浓度较低则所加抗生素的量也要相应降低一些。

(9) 建议用1N HCl或1N NaOH来调节培养基的pH,因为用碳酸氢钠调pH值对培养液的渗透压影响比较大。如下图所示:

细胞培养基使用方法(微孔滤膜过滤除菌)

图2 MEM SLM(SLM120)在相同pH值时所加的碳酸氢钠、氢氧化钠的量及所对应的培养液渗透压

细胞培养基使用方法(微孔滤膜过滤除菌)

图3 199(MD502)在相同pH值所加的碳酸氢钠、氢氧化钠的量及所对应的培养液渗透压

4、灭菌方法

培养基的灭菌方法主要有两种,高压除菌及0.22um微孔滤膜过滤除菌。与过滤相比,高压灭菌的工作强度小,成本较低,但易造成营养成分的流失,而且在多次加样(无菌谷氨酰胺溶液,无菌碳酸氢钠溶液等)过程中容易造成二次污染。大多数培养基采用0.1~0.2μm孔径的微孔滤膜进行过滤灭菌,并且已成为培养基除菌的发展方向,它可低限度地减少培养基的营养损失。

4.1 高压灭菌

某些培养基(如MEM)可进行高压灭菌,例如清大天一的MEM培养基中的MD605、MD609等。这类培养基一般不含有L-谷氨酰胺和碳酸氢钠,一般是在培养基高压灭菌后加入L-谷氨酰胺和碳酸氢钠的无菌的液体。另外可高压的谷氨酸盐(如L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)可代替L-谷氨酰胺。

可高压灭菌的培养基在121℃、15psi,15分钟的条件下完全可达到灭菌效果及营养成分的最小损失,不需将灭菌时间延长。为保证高压灭菌的效果,灭菌设备的验证很关键。

4.2 过滤灭菌

可供过滤灭菌使用的滤膜很多,其材料多为polyethersulphone(PES)、尼龙、多聚碳酸盐、醋酸纤维素、硝酸纤维素、PTFE、陶瓷等。一般情况下采取正压过滤,正压过滤较之负压过滤具有流速高、过滤快、不易污染,可避免蛋白质产生大量气泡等优点。一般使用过滤器可参照各供应商的产品说明书。

目前大多数实验室和制药企业采用微孔滤膜滤器(如Zeiss滤器)或立式微孔滤器(Millipore、Pall)除菌。微孔滤膜滤器为不锈钢,中间可夹放0.22um滤膜。使用这种滤器最重要步骤是安装滤膜及无菌过滤过程。如在使用Zeiss滤器时,先要用培养用水将滤膜充分润湿,在安装滤膜时可在其上放置一层定性滤纸再固定。消毒时旋钮不要扭太紧,凡与空气接触部位都要包好(可用牛皮纸、纱布、无纺布等);高压灭菌后,在无菌环境中立即将旋钮扭紧。过滤除菌结束后,要打开滤器,检查滤膜是否完整,如果滤膜破裂,需重新进行过滤除菌过程。立式微孔滤器可以选用不同的微孔滤柱体积,因为滤膜的折叠,膜面积显著增大,液体处理量大,而且不容易发生堵塞现象。

5、细胞培养液的储存

细胞培养液的储存条件一般为2~8℃、密闭、避光保存,但要注意如下几点:

(1) 过滤后的完全培养液,即添加了血清、谷氨酰胺、抗生素等的培养液要尽快使用,一般在2~3周内使用完。

(2) 灭菌后的未加L-谷氨酰胺等添加剂的培养基溶液,一般可在4℃保存6~9个月,也可冷冻保存,用时解冻。

(3) 高压除菌后的培养基应置4℃保存,不能因为其可耐受高温而忽略储存温度。

(4) 添加了谷氨酰胺的培养液放置2周后,要补加和原来同样量的谷氨酰胺,但这样并不能消除谷氨酰胺降解产生的游离氨,建议配制好的培养液尽快使用。

细胞培养基使用方法(微孔滤膜过滤除菌)

图4 pH为7.6时不同温度2mM谷氨酰胺的稳定性

细胞培养基使用方法(微孔滤膜过滤除菌)

图 5 室温下不同pH时10mM谷氨酰胺的稳定性

(5) 添加某些生长因子、激素等添加物,可能会改变培养液的储存条件,比如温度、时间等方面的要求。

细胞培养基从1903年开始发展到现在,有199、MEM、DMEM、RPMI1640等基础细胞培养基,还有低血清细胞培养基、无血清细胞培养基甚至无蛋白培养基,种类繁多、各具特点。在使用过程中,只有根据各类细胞培养基的特性、特点正确的选择配制方法、灭菌方法、储存方法,才能最大程度地保持细胞培养基的营养,发挥细胞培养基的功效。

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