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细胞培养基的选择及常用数据库

摘要 : 经典的培养基有很多种,Invitrogen(GIBCO)、Thermo Fisher(HyClone)、Sigma等公司都可以提供。其中DMEM、RPMI 1640、MEM、DMEM/F12都是应用最广泛的培养基。其他如M199、IMDM、L15培养基等也用于某些细胞的培养。

经典的培养基有很多种,Invitrogen(GIBCO)、thermo fisher(HyClone)、Sigma等公司都可以提供。其中DMEM、RPMI 1640、MEM、DMEM/F12都是应用最广泛的培养基。其他如M199、IMDM、L15培养基等也用于某些细胞的培养。

◆ MEM是由Eagle’s基础培养基(BME)发展而来的,其中增加了组分的范围及浓度。

◆ Dulbecco改良的BEM(DMEM)培养基是为小鼠成纤维细胞设计的,现在常用于贴壁细胞的培养。DMEM的氨基酸浓度是MEM的两倍,维生素浓度是MEM的4倍,采用双倍的HCO3-和CO2浓度起到更好的缓冲作用。最初的配方中葡萄糖含量为1000 mg/L,后来为了某些细胞的生长需要,将葡萄糖含量又调整为4500 mg/L,这就是大家常说的低糖和高糖了。

◆ aMEM含有附加的氨基酸、维生素以及核苷和脂肪酸,它可广泛应用于各种细胞类型,包括对营养成分要求苛刻的细胞。

◆ Ham’s F12是为在低血清浓度下克隆CHO细胞而设计的,现在也广泛应用于克隆形成率的分析及原代培养。F12还可以与DMEM等体积混合使用,得到一种高浓度与成分多样化相结合的产物,这种培养基已应用于许多原代培养及更难养的细胞系的培养。

◆ RPMI 1640培养基是专为淋巴细胞培养而设计的,现在已广泛应用于悬浮细胞的培养。

以前经常听到有人问,这种细胞该用哪一种培养基呢?其实这个问题的答案可以很简单,也可以好复杂。此话怎讲?如果这种细胞是购自ATCC或其他的细胞库,那很简单,问供应商就行了。或者找到相关的文献,作为参考。invitrogen网站上有一个Cell Line Database的工具,也很好用。选择你感兴趣的细胞类型,它就会弹出推荐的培养基、血清和转染试剂等,有时还有优化好的转染步骤,很方便。Sigma网站上也有一个Media Expert,包括了培养基所有成分的功能描述、使用推介和参考文献等,它还是一个解决问题能手,对于细胞培养中的常见问题,如细胞贴壁不好、培养基变色等,它都会列出可能的原因,并提供补救办法。这个Expert果然不简单!

但如果你是着手建立一种全新细胞的培养体系,根本找不到任何参考,那你就得花点时间自己试验了。万事开头难嘛。因为没有一个标准答案。在MEM中培养的细胞,很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之,首选MEM做贴壁细胞培养、RPMI 1640做悬浮细胞培养会是一个好的开始。你也可以购买几种培养基来,然后花大约两周的时间做一个简单的细胞生长实验,来选择其中最适合的。有时候你会惊讶地发现你的最佳培养条件与文献报道的不同,就算是同一种培养条件,细胞的生长状态也时好时坏,这是很正常的。因为试剂、水、不同批号的血清之间都存在着差异。要提高培养基的稳定性,可以从培养基和血清两方面入手。

以前大部分实验室都是用干粉培养基,但配制过程就较为繁琐,要溶解、调pH值,过滤,过程中可能会产生一些浓度误差,而且有些实验室的水质并不理想,所以培养的效果会有差异。如果使用液体培养基,这种人为的误差会减少,因为毕竟是大批量工业化生产的,批间差会很小。大家是不是感觉液体培养基会贵很多,以前是这样,但现在非也。HyClone和Invitrogen都在国内建立了液体培养基的生产基地,生产和运输成本大幅降低,所以现在的价格也只是50-60元/500ml,比干粉培养基贵不了多少,而且还帮你省了过滤器和时间。

血清含有生长因子可促进细胞的繁殖,含有附着因子可促进细胞的贴壁,同时还具有抗胰酶活性。血清同时也是矿物质、脂类及激素的来源。最常用的血清有小牛血清、新生牛血清、胎牛血清和马血清等。牛血清是按照采血时间的早晚来分类的。采血时间越早,营养物质越丰富,所含抗体也越少,因而胎牛血清适合要求高的细胞系和克隆化培养。由于疯牛病的原因,到目前为止,我国政府仍然禁止从北美洲、欧洲和日本等地区进口牛血清,因此市面上的牛血清大多来自澳洲、南美洲,或是国产的。

而血清批次间的差别就是不可避免的,这种差异来源于不同的制备方法和除菌方法、动物的年龄差别及血清的储存条件等,而且与取血动物的来源关系密切。不同的牧场、不同的气候天气及其他环境因素都可能影响血清的质量。因此选好了一种血清就要尽可能长期使用它。在需要更换时,也要尽量保持与原有的一批血清相似。现在很多公司都提供血清预留,你一旦选定了某个批次的血清,最好备足一年的量,这样可以避免很多麻烦。

血清固然是细胞培养中不可或缺的成分,但正如上文所说,血清的批间差异大,更换血清时需要做大量的测试以取保替换的血清与原来的相似。而血清的供应也是必须要考虑的因素。由于气候或疯牛病的影响,说不定哪天血清就突然没得卖了,那对实验的影响可非同小可。另外,血清的价格也很昂贵,虽说现在也有便宜的国产血清,但是高品质的澳洲血清价格仍旧高企。因此,也有一些实验室开始换用无血清培养基。

无血清培养基(Serum-Free Media),通常以SFM表示,顾名思义,就是在细胞培养中不需要添加血清,但是在某些应用中可能要添加生长因子或细胞因子。无血清培养基中添加了血清的主要成分:粘附因子、生长因子、必需的营养物质和激素等,能减少上述血清带来的不利因素,使细胞培养的条件更稳定。但它也不是完美的,从有血清培养过渡到无血清培养的条件并不像想象中那么直截了当。处于发育的不同分化阶段的细胞(例如干细胞与定向前体细胞相比)需要不同的配方,对生长因子和细胞因子的选择尤为重要。而且在去除血清的同时,也去除了一些血清蛋白具有的保护、解毒作用,因此对试剂、水的纯度和仪器清洁度的要求更高。另外,它的价格也比普通的培养基贵很多。

现在有很多厂家生产无血清培养基。GIBCO这个细胞培养的金字招牌当然少不了,它也是最早研制无血清培养基的。目前已经开发了ES细胞、杂交瘤、CHO、293、昆虫细胞、神经细胞、淋巴细胞、角质细胞、内皮细胞等多种细胞的无血清培养基。上个月还推出了首个间充质干细胞的无血清培养基,能使MSC维持未分化状态超过9代。HyClone公司也有CHO、293、杂交瘤细胞、昆虫细胞、病毒疫苗细胞的多种无血清培养基。Sigma则刚刚收购了澳大利亚JRH公司,有了JRH的EX-CELL系列,无血清培养基的选择也更多了。

这么多种,要选择起来也是个头疼的事情。除了部分培养基是公开配方的,如用于培养内皮细胞的MCDB 131(Sigma),大部分液体培养基都是专利配方的,也就是说其中的成分是保密的。那么你只能是检索文献、让供应商推荐,然后用自己的细胞做几次传代培养来选出最合适的培养基。毕竟实践出真知嘛。

P.S.附上一些细胞培养中的小Tip,可能会对您有所启发。(部分摘自Invitrogen的中文Focus)

• 切记,细胞培养基的储存条件是2-8摄氏度。如果细胞培养基不小心被冻,您应该融化培养基并观察是否有沉淀产生。如果没有沉淀产生,培养基可以正常使用,如果出现沉淀,只能丢弃这些培养基。

• 贮存在冰箱中的瓶口已开的培养基,可能在放置几天后颜色变紫。这主要是由于在暴露到周围的CO2水平时,碳酸氢纳导致了pH值的上升。您可以在使用前松开瓶口,在CO2培养箱孵育培养基10-15分钟,来校正溶液的pH值(确定松开瓶口以保证气体交换)。

• 当在无血清培养基中添加抗生素时,降低至少在有血清培养基中所使用浓度的50%。血清蛋白会结合和灭活一些抗生素。在无血清培养条件下,抗生素不被灭活,可能对于细胞达到毒性水平。

• 一旦您在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时,您应该在两到三周内使用它。因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解。

• 总之,大部分添加物和试剂最多可以冻融3次,如果次数更多都会在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀,将会影响它的性能。

• 血清的热灭活在免疫分析时可以灭活补体系统。在免疫学研究,培养ES细胞,昆虫细胞和平滑肌细胞时,推荐使用热灭活血清。热灭活是以往公认的操作步骤,并没有确凿的证据说明这样做是有益的。相反,对大部分细胞而言,GIBCO和HyClone都不推荐热灭活血清。因为加热可能使血清中的沉淀增加,使您误以为污染。

• 如何避免血清中沉淀物的产生?

1. 解冻血清时,请按照所建议的逐步解冻法(-20℃至4℃至室温),若血清解冻时改变的温度太大(如-20℃至37℃),实验显示非常容易产生沉淀物。并随时将之摇晃均匀,使温度及成分均一,减少沉淀的发生。

2. 请勿将血清置于37℃太久。若在37℃放置太久,血清会变得混浊,同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害,而影响血清的质量。

3. 血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多,若非必要,可以无须做此步骤。

4. 若必须做血清的热灭活,请遵守56℃,30分钟的原则,并且随时摇晃均匀。温度过高,时间过久或摇晃不均匀,都会造成沉淀物的增多。

• 在进行传代培养时,我们强烈推荐进行台盼兰活性记数。研究者常常通过一个简单的稀释(1∶4或1∶2)进行传代,不进行活性检测,您可能接种比你认为的低的多的浓度的细胞,这常常可能导致生长缓慢或培养物根本不生长。

• 贮存在4℃冰箱中的液体胰蛋白酶溶液只能使用一周。胰蛋白酶在4℃就可能开始降解,如果在室温下放置超过30分钟,就会变得不稳定。

• 在订购的细胞到达后,应立即复苏,如果培养基还没有准备好,可将其放入液氮中,尽快复苏。千万不能放置在-20或-80℃的冰箱内。

• 细胞复苏往往是比较容易出问题的步骤。请在订购细胞时就向供应商索取详细的复苏步骤,并仔细阅读。有些供应商就不推荐在复苏时离心,对此类细节,应特别留意。

国内外的主要细胞库:

ATCC(细胞株及胚胎干细胞库)

1)下载细胞库目录:http://www.atcc.org/pdf/tcl.pdf

2)查询细胞株:http://www.atcc.org/SearchCatalogs/CellBiology.cfm

3)胚胎干细胞库:http://stemcells.atcc.org/products/cells.cfm

ECACC(European Collection of Cell Cultures)

http://www.ecacc.org.uk/

中国科学院上海细胞库/干细胞库

http://www.cellbank.org.cn/

中国典型培养物保藏中心(也称武汉大学保藏中心)

http://sub.whu.edu.cn/cctcc/

中国医学科学院基础医学研究所细胞中心(协和细胞库)

http://sbm.pumc.edu.cn/xibaozhongxin/index.htm

细胞培养是实验室里最常见和最基本的实验了,但却不是最简单的。别小看细胞培养,这里可蕴含着大学问。有时候细胞状态不好,转染、药筛这些实验根本就没办法做。影响细胞培养的因素很多,让我们先从培养基和血清说起。

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