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天然细胞培养基

摘要 : 天然培养基是指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基,如血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等。组织培养技术建立早期,体外培养细胞都是利用天然培养基。但是由于天然培养基制作过程复杂、批间差异大,因此逐渐为合成培养基所替代。

天然培养基是指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基,如血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等。组织培养技术建立早期,体外培养细胞都是利用天然培养基。但是由于天然培养基制作过程复杂、批间差异大,因此逐渐为合成培养基所替代。目前广泛使用的天然培养基是血清,另外各种组织提取液、促进细胞贴壁的胶原类物质在培养某些特殊细胞也是必不可少。

一、血清(serum)细胞培养的发展,培养基的质量又是关键,而培养基的主要成份中动物血清对细胞的生长繁殖发挥着重要甚至是难以替代的作用。在动物血清的应用中牛血清又是最为广泛的,所以血清是医药生物技术产品中重要的原材料之一。保证血清质量也是促进生物制品质量提高的重要环节。

1.血清种类:目前用于组织培养的血清主要是牛血清,培养某些特殊细胞也用人血清、马血清等。选择用牛血清培养细胞的原因:来源充足、制备技术成熟、经过长时间的应用考验人们对其有比较深入的理解。牛血清对绝大多数哺乳动物细胞都是适合的,但并不排除在培养某种细胞时使用其他动物血清更合适。

牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基,含有丰富的细胞生长必须的营养成份,具有极为重要的功能。牛血清分为小牛血清、新牛血清、胎牛血清。胎牛血清应取自剖腹产的胎牛;新牛血清取自出生24小时之内的新生牛;小牛血清取自出生10-30天的小牛。显然,胎牛血清是品质最高的,因为胎牛还未接触外界,血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少。

2.血清的主要成分:血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的一种很复杂的混合物,其组成成份虽大部分已知,但还有一部分尚不清楚,且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异。血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等,这些物质对促进细胞生长或抑制生长活性是达到生理平衡的。对血清的成分和作用的研究虽有很大进展,但仍存在一些问题。主要是:

第一:血清的成份可能有几百种之多,目前对其准确的成份、含量及其作用机制仍不清楚,尤其是对其中一些多肽类生长因子、激素和脂类等尚未充分认识,这给研究工作带来许多困难;

第二:血清都是批量生产,各批量之间差异很大,而且血清保存期至多一年,因此,要保证每批血清的相似性极为困难,从而使实验的标准化和连续性受到限制;

第三:不能排除血清中含有易变物质,这被认为是“瓶中恶化”的原因之一。

3.血清主要作用:

●提供基本营养物质:氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等,是细胞生长必须的物质。

●提供激素和各种生长因子:胰岛素、肾上腺皮质激素(氢化可的松、地塞米松)、类固醇激素(雌二醇、睾酮、孕酮)等。生长因子如成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板生长因子等。

●提供结合蛋白:结合蛋白作用是携带重要地低分子量物质,如白蛋白携带维生素、脂肪、以及激素等,转铁蛋白携带铁。结合蛋白在细胞代谢过程中起重要作用。

●提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤。

●对培养中的细胞起到某些保护作用:有一些细胞,如内皮细胞、骨髓样细胞可以释放蛋白酶,血清中含有抗蛋白酶成分,起到中和作用。这种作用是偶然发现的,现在则有目的的使用血清来终止胰蛋白酶的消化作用。因为胰蛋白酶已经被广泛用于贴壁细胞的消化传代。血清蛋白形成了血清的粘度,可以保护细胞免受机械损伤,特别是在悬浮培养搅拌时,粘度起到重要作用。血清还含有一些微量元素和离子,他们在代谢解毒中起重要作用,如SeO3,硒等。

4.细胞培养中使用血清的缺点

血清成分复杂,虽含许多对细胞有利成分,也含有对细胞有害的成分,使血清有几个明显的缺点:

●对大多数细胞,在体内状态,血清不是它们接触的生理学液体,只是在损伤愈合以及血液凝固过程中才接触血清,因此使用血清有可能改变某种细胞在体内的正常状态,血清可能促进某些细胞的生长(成纤维细胞)同时抑制另一类细胞生长(表皮细胞)。

●血清含一些对细胞产生毒性的物质,如多胺氧化酶,能与来自高度繁殖细胞的多胺反应(如精胺、亚精胺)形成有细胞毒性作用的聚精胺。补体、抗体、细菌毒素等都会影响细胞生长,甚至造成细胞死亡。

●动物个体不同,血清产地、批号不同,每批质量差异甚大,其成分不能保持一致。

●取材中可能带入支原体、病毒,对细胞产生潜在影响,可能导致实验失败或实验结果不可靠性。

●血清的使用使得实验和生产的标准化困难,其中的蛋白质使得某些转基因蛋白生物药品生产中分离纯化工作很难完成。

●大规模生产中,血清来源越来越困难,价格昂贵,是构成动物细胞培养对生产成本的主要部分之一。

5.血清的质量标准:血清质量高低取决于两方面因素:一是取材对象,二是取材过程。用于取材的动物应健康无病并且在指定的出生天数之内,取材过程应严格按照操作规程执行,制备出的血清要经过严格的质量鉴定。WHO公布的《用动物细胞体外培养生产生物制品规程》中的要求:

▲牛血清必须来自有文件证明无牛海绵状脑病的牛群或国家。并应具备适当的监测系统。

▲有些国家还要求牛血清来自未用过反刍动物蛋白饲料的牛群。

▲证明所用牛血清中不含对所生产疫苗病毒的抑制物。

▲血清要通过滤膜过滤除菌,保证无菌。

▲无细菌、霉菌、支原体和病毒的污染,有些国家要求无细菌噬菌体污染。

▲对细胞有良好的支持繁殖作用。

我国在对牛血清的质量2000年版《中国生物制品主要原辅料质控标准》中提出比较严格的标准要求。包括蛋白质含量,细菌、真菌、支原体、牛病毒、大肠杆菌噬菌体、细菌内毒素,支持细胞增殖检查。

血清质量的鉴定一般包括以下几个方面:

●理化性质:如渗透压、pH值、蛋白电泳图谱、蛋白含量、激素水平、内毒素等。蛋白含量包括血清总蛋白含量(不低于35-45g/L)、球蛋白含量(应小于20g/L)、血红蛋白含量等。其中球蛋白含量是一项非常重要的指标,血清中球蛋白主要是抗体,球蛋白含量越低血清质量越高。血红蛋白也是越低越好。

●微生物检测:包括细菌、真菌、支原体、病毒等。特别是对支原体、病毒的检测,支原体是一种很小的微生物,可通过孔径22u的滤膜。支原体、病毒污染在光学显微镜下难于察觉,细胞也能生长繁殖,但会影响实验结果。检测支原体的方法很多,如培养法、PCR法、荧光染色法、电镜观察法等。

●促生长效果:这是血清重要的特性之一,应当以培养的细胞来检测。有两种方法:克隆形成率、贴瓶率测定法和连续传代培养法。

(1)克隆形成率测定:一般以悬浮生长的细胞为培养对象,按有限稀释法做克隆化培养,将不同批号的血清配制成不同浓度的培养基,细胞也稀释成不同浓度,接种到96孔板,每孔200ul,培养一定时间,统计有克隆生长的孔,计算出百分比,再与对照的标准血清相比较,就可看出不同批号血清间的区别。比较低的浓度,更能观察出血清质量间的细微差别。

(2)贴瓶率测定:是以贴壁细胞为培养对象,将细胞稀释至低密度,接种至平皿,每皿200或100个细胞,以不同浓度的血清培养基培养,培养一定时间后弃培养基,染色后统计集落数,计算出集落数占接种细胞数的百分比,同样再与标准血清比较,判断血清质量高低。

(3)连续传代培养法:是将细胞培养于3个一定体积的培养瓶中,待测血清配制为5%浓度,一般于第七天收集细胞,计数,取平均值,中间可以更换一次培养基。连续测试三个周期以上,观察细胞生长状况,并将每次的计数结果与标准血清的测试结果比较。

●对于使用者,判断血清质量先从外观入手。好的血清应该是透明清亮,土黄色或棕黄色,无沉淀或极少沉淀,比较粘稠。如发现血清浑浊、不透明、含许多沉淀物,说明血清污染或血清中的蛋白质变性;若血清呈棕红色,说明血清中的血红蛋白含量太高,取材时有溶血现象;如果摇晃时感觉液体稀薄,说明血清中掺入的生理盐水太多。如果要进一步了解血清的质量,则应连续培养某些细胞,观察细胞生长状况。

6.血清的使用与储存:正确的使用及保存血清,才能使血清发挥应有的作用。

●使用前处理:大部分血清在使用前必须灭活处理,即56℃30分钟。灭活的目的是去除血清中的补体成分,避免补体对细胞产生毒性作用。血清经过灭活也会损失一些对细胞有利的成分,如生长因子,因此也有人提出血清不经灭活直接用于培养,这样做的前提是确认血清中不含补体成分。对于一些品质高的胎牛血清和新牛血清可以考虑不经灭活直接用于细胞培养。

●储存条件:血清一般储存于-20℃,同时应避免反复冻融。购买大包装的血清后,首先要灭活处理,然后分装成小包装,储存于-20℃,使用前融化。融化时最好现置于4℃。融化后的血清在4℃不宜长时间存放,应尽快使用。

●使用浓度:自从有了合成培养基,血清就是作为一种添加成分与合成培养基混合使用,使用浓度一般为5-20%,最常用是10%。过多血清容易使培养中的细胞发生变化,特别是一些二倍体的无限细胞系,迅速生长之后容易发生恶性转化。

●采购血清时,最好先从供应商处索取样品进行试验,选定一批后就要保留足够使用6个月至1年的量,直至用另一批经过预先试验的样品代替。

二、胚胎浸出液

胚胎浸出液(embryonic extract)是早期动物细胞培养中应用的天然培养基,现已很少使用。

三、水解乳蛋白 水解乳蛋白(lactalbumin hydrolysate)为乳白蛋白经蛋白酶和肽酶水解的产物,含有丰富的氨基酸,是常用的天然培养基,可用于许多细胞和原代细胞的培养。

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