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培养基制备的基础实验

标签: pH值 培养基 琼脂
摘要 : 目的要求:1.掌握一般培养基制备的原则和要求。2.熟悉一般培养基制备的过程。

目的要求

1.掌握一般培养基制备的原则和要求。

2.熟悉一般培养基制备的过程。

操作步骤

一、培养基的制备原则和要求

培养基是根据各类微生物生长繁殖的需要,用人工方法把多种物质混合而成的营养物。一般用来分离、培养菌类。常用的培养基有基础培养基、增菌培养基、选择培养基、鉴别培养基和厌氧培养基。在制备培养基时,应掌握如下原则和要求:

(一)培养基必须含有细菌生长繁殖所需要的营养物质。所用的化学药品必须纯净,称取的份量务必准确。

(二)培养基的酸碱度应符合细菌生长要求。按各种培养基要求准确测定调节pH值。多数细菌生长的适宜pH值为7.2~7.6,呈弱碱性。

(三)培养基的灭菌时间和温度,应按照各种培养基的规定进行,以保证灭菌效果及不损失培养基的必需营养成分。培养基经灭菌后,必须置37℃温箱中培养24小时,无菌生长者方可应用。

(四)所用器皿须洁净,忌用铁或钢质器皿,要求没有抑制细菌生长的物质存在。

(五)制成的培养基应该是透明的,以便观察细菌生长性状以及其他代谢活动所产生的变化。

二、培养基制备过程

不同的培养基其制备方法也不同,一般包括以下步骤:

(一)准确称量试剂 根据不同的菌类和用途,选择适宜的培养基,培养基所需试剂必须纯净。

(二)校正pH值 将称量好的培养基各种成分放入容器内,标记划线,加热溶解,补充水分,测定酸碱度,常用pH6.8~8.0的精密试纸或酸度计测定。用1N NaOH和1N HCl调节pH值到适宜范围内。

(三)过滤 将玻璃漏斗置铁架上,再用纱布夹棉花或用滤纸放在漏斗中,将上述培养基倒入其中过滤至透明。

(四)分装 将过滤后的培养基分装于中试管或三角瓶内(试管内每支装5mL;三角瓶中装100~150ml),塞好棉塞用牛皮纸包扎好,准备灭菌。

(五)灭菌 培养基的灭菌,常用高压蒸汽灭菌法。一般微生物的营养细胞在水中煮沸后即被杀死,但细菌的芽胞有较强的抗热性,须经高压蒸汽灭菌才能达到彻底灭菌的目的。根据蒸汽温度随压力升高而上升的原理,即压力越大,蒸汽温度就越高。因此,在同一温度条件下,采用高压蒸汽灭菌比干热灭菌法效果要好。而且在湿热情况下,菌体吸收水分后,其蛋白质易于凝固变性,因为蒸汽的穿透力强,杀菌效果好。

高压蒸汽灭菌,一般采用15磅/平方(即1.05kg/cm2)压力,此时的温度是121.3℃。灭菌20~30分钟后,可达到完全灭菌的目的。在进行灭菌的时候,首先要把灭菌锅内的冷空气排出,否则,冷空气存在会降低锅内的实际温度,影响灭菌效果。

三、基础培养基的制备

(一)牛肉浸液(肉水)

1.成分 新鲜牛肉 500g ,水1000 ml。

2.制法

(1)取新鲜牛肉,剔除肌膜、脂肪,切成小块,用绞肉机绞碎。

(2)按上述比例加水,浸泡过夜(夏天应将浸泡液放置在低温的地方,防止腐败;如果没有冷藏条件时,可省去浸泡过夜这一步),其间应搅拌数次。

(3)次日取上液煮沸一小时,并不断搅拌。

(4)补足蒸发的水分,用白布或绒布过滤后分装于三角瓶中,准备灭菌。

(5)置高压灭菌器内,15磅灭菌20~30分钟,置低温、暗处保存备用。

3.用途

用于制备各种培养基的基础液。

(二)肉浸液肉汤(普通肉汤)

1.成分 肉水 1000 ml ,蛋白胨 10g,氯化钠 5g,磷酸氢二钾 2g。

2.制法

(1)将以上成份加温溶于牛肉浸液中。

(2)调pH值为7.4~7.6。

(3)滤纸过滤后分装。

(4)15磅20~30分钟灭菌后备用。

3.用途 作一般细菌培养用。

(三)营养琼脂培养基(普通琼脂)

1.成分 肉水 1000ml,蛋白胨10g,磷酸氢二钾 lg ,氯化钠 5g,琼脂 20g。

2.制法

(1)将上述成分混合后,加热溶解,补足水份。

(2)校正pH值7.4~7.6。

(3)用纱布夹棉花过滤。

(4)分装于中试管或三角瓶中。

(5)高压灭菌20~30分钟后,将中试管摆成斜面,保存备用。

3.用途 一般细菌分离培养、菌种保存或用作特殊培养基。

(四)半固体培养基 基本上与营养琼脂的制备相同,仅将琼脂量减少至0.5~0.7%(1000 ml中加5~7g琼脂)即可。

(五)鲜血琼脂 将灭菌的营养琼脂加热溶化,冷却至45~50℃时,加入5~8%无菌脱纤鲜血(绵羊、黄牛、马和兔等),分装于试管后立即摆成斜面、或倾注于平皿中,待凝固后,置37℃培养1~2日。有污染者废弃;无菌者保存,置冰箱备用。

无菌脱纤维鲜血的制备:以无菌操作采取动物鲜血(绵羊、黄牛、马从颈静脉采血;兔则从心脏采血),放入带玻璃珠的无菌三角瓶内,摇动5~10分钟,放冰箱中备用。

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