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标签:blotNorthern甲基二醛

这一方法原于McMaster和Carmichael(1977)。 含有乙二醛-DMSO的凝胶比含有甲醛的凝胶更难于进行电泳, 因为前者泳动速率较慢而且需将电泳液时行循环以避免电泳过程中形成过高的H+梯度。尽管上述两种凝胶具有近乎相等的分辨率(Miller,1987),但用含朋乙二醛-DMSO的凝胶对RNA进行分级离,通常Northern杂交所显示的RNA条带更为锐利。

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1.制胶:(1%) 琼脂糖 2.5g 10Mops缓冲液 25.0ml H2O 192.0ml 2.在微波炉中加热煮沸使胶完全溶于水并灭菌。 3.取出胶冷却到60℃,于通风柜中加45ml甲醛,混匀。 4.加20l溴化乙锭,混匀。 5.令胶液再冷却10分钟。 6.将其倒入四面封好的电泳槽中,加样品梳,约20分钟形成电泳凝胶。 7.加入1Mops缓冲液于电泳槽,盖满胶表面,但不1cm。 8.取10~15g RNA样品,真空离心干燥,再溶于20l载样缓冲液,加

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方法一、改良异硫氰酸胍提取法 试剂及其配制 异硫氰酸胍变性液: 贮存液-在含484ml 水(经DEPC处理), 17.6ml 0.75mol/L柠檬酸钠(pH7.0)和26.4ml10%Sarkosyl的溶液中加入250g异硫氰酸胍,加热至60~65℃并持续搅拌使之充分溶解。贮存液室温保存备用(不超过3个月)。 工作液-在每50ml贮存液中加入0.35ml2-ME即配制成工作液。工作液于室温下保存不超过1个月。工作液各成分的终浓度为: 4mol/L异硫氰酸

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二、RNA质量检测 提取的RNA需要对其质量和数量进行检测。实验室常用的方法有紫外吸收值检测和电泳检测两种。 方法一、紫外吸收检测 试剂:TE ( 10mmol/L Tris, 1mmol/LEDTA)。 dH2O 试验程序 1.预热紫外分光光度计10~20min.。 2.取两个1ml的狭缝石英杯,一个装入1mlTE溶液作为空白校正液,用来校正分光度计零点及调整透光度至100。 3.取4l RNA待测样品加入另一比色杯中,加dH2O至1ml,用无菌

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A. 载体选择 为了获得能够在体外转录RNA探针的DNA模板,其克隆载体必须带有可供选择的特异转录启动子,同时,为了获得理想的Northern杂交试验结果,载体选择带有两种不同类型而方向相反启动子的载体,以便在RNA探针制备时同时得到两条链的转录探针。 常用的这类载体有:pGEM-3/pGEM-4 ( 2.87kb, SP6/T7 ). pGEM-3Z ( 2.74kb, T7/SP6 ). PGEM-3Zf(-) (3.2kb, T7/SP6 ). Bluescript M13- (2.96kb, T7

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A.质粒DNA的小量提取 试剂及其配制 含AP的LB液体培养基 TE缓冲液:10mmol/L Tris-HCl (pH 8.0) 1mmol/L EDTA (pH 8.0) 溶液I: 25mmol/L Tris-Cl (pH 8.0) 10mmol/L EDTA 50mmol/L 葡萄糖 高压灭菌15min.后,4℃贮存。 溶液II: 0.2mol/L NaOH 1% SDS(临用前现配制) 溶液III(100ml):5mol/L 乙酸钾 60ml 冰乙酸 11.5ml dH2O 28.5ml 4℃贮存。

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五、RNA探针制备(根据the DIG system users guide) A. 地高辛标记的体外转录 试剂及其配制(试剂盒提供): 10 NTP标记混合物:in Tris-HCl (pH 7.5) 10mmol ATP 10mmol CTP 10mmol GTP 6.5mmol UTP 3.5mmol DIG-UTP 10 转录缓冲液:400mmol Tris-HCl(pH 8.0) 60mmol MgCl2 100mmol DTE(dithioerythritol) 20mmol亚精胺 100mm

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探针准备 DIG标记的RNA探针与DNA探针相比,显示较强的杂交信号和较地的非特异性背景,因此,只要可能选用RNA探针可以比DNA探针获得更好的杂交结果。如果必须使用DNA探针,建议使用高SDS杂交缓冲液或DIG Easy Hyb以减少背景。 在正式杂交试验之前,优化杂交探针浓度是避免颜色背景所必须的。探针浓度的确定可通过模拟杂交进行。取一小片空白膜,将其浸入不同探针浓度的溶液中

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方法一、化学发光检测 试剂及其配制: 洗膜缓冲液:100mmol Maleic acid 150mmol NaCl 0.3%(v/v) Tween20 pH 7.5 Maleic acid缓冲液:100mmol Maleic acid 150mmol NaCl pH 7.5 封闭液:5% (w/v) SDS 17mmol/L Na2HPO4 8mmol/L NaH2PO4 室温保存,如果需要,用0.45m的滤膜过滤除菌。 检测缓冲液:100mmol Tris-HCl(pH 9.5) 100mmol NaC

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Prehybridization/Hybridization Solution 0.1% SDS 50% Formamide 5x SSC 50 mM NaPO4, pH 6.8 0.1% Sodium Pyrophosphate 5x Denhardt"s Solution 50 ug/ml Sheared Herring Sperm DNA 1) Air dry blot. Crosslink in Stratalinker or 30 seconds on UV Transilluminator.

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