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如何测试sgRNA的效率

为了成功编辑你感兴趣的基因组,关键的一步是测试你设计的sgRNA。幸运的是,已经开发了一些程序,例如用于斑马鱼的CRISPRscan、SSC、CRISPR的序列扫描或WU-CRISPR,您可以使用它们来预测sgRNA的效率和适用性。然而,这些计算工具的预测效率远不理想。虽然大多数时候你的sgRNA可能会起作用,但有时候却不会。因此,您需要使用可靠的系统测试您的sgRNA和Cas9的切割效率。

在您最喜欢的系统中使用sgRNA之前,有一些简单的方法可以测试它。这些方法是基于体内或体外的方法。

体外sgRNA测试

sgRNA的体外检测方法是一种流行的、易于建立和使用的方法。首先,使用T7体外转录和凝胶纯化技术合成sgRNA。你可以从两个退火的单链寡核苷酸或一个质粒克隆作为你的模板。在sgRNA的合成上有一些方法和协议可以在线获得。

接下来,添加你sgRNA DNA模板(通常是你的基因感兴趣的区域)的PCR产物,Cas9信使rna和蛋白质和孵化37°C的混合。确保你运行你的控制!对于阴性对照,我包括一个管不包含Cas9。与此同时,我用经过验证的sgRNA进行反应,以得到阳性对照。培养1 - 2小时37°C,然后运行样本2%的凝胶。如果你看到两个或更多的乐队,恭喜你!你成功的分裂了你的DNA模板。

这个测试非常容易执行,并且很容易在几个小时内弄清事情是否正常运行。甚至还有一些商业工具包来简化这项任务。不过要小心,这个系统并不完美。一些有效的sgRNAs在体内不能很好地工作。这通常是由于细胞环境阻止Cas9/sgRNA复合物的形成和/或抑制卵裂。

在细胞系或胚胎中进行体内sgRNA检测

体内测试系统对于sgRNA或Cas9酶的测试无疑更可靠。然而,由于需要克隆步骤,它们会花费一些时间;你肯定不会在几个小时内得到结果。

有很多方法可以测试你体内的sgRNA。您可以在组织培养的细胞系中或在模型生物体中测试引导。对于模型生物,你直接在胚胎中测试sgRNA,然后将胚胎培养到可以提取DNA进行基因分型和T7内切酶分析(T7E1)的阶段。

在细胞系

为了在细胞系中进行测试,您可以使用您最喜欢的转染方法将sgRNA和Cas9传递到细胞中。一个很好的方法就是克隆你的sgRNA到一个同样包含Cas9基因、U6启动子和GFP报告子的载体中(例如使用Zheng实验室的Px458载体,可以在Addgene上找到)。转染后,检查细胞内的荧光水平,找到转染的细胞,然后培养细胞,提取DNA(你不需要克隆,唯一需要评估的是sgRNA的效率)。使用PCR检查编辑使用T7E1化验。这个系统在细胞系中有许多变体。例如,你可以在质粒中使用抗生素耐药盒来选择转染的细胞,而不是GFP。

在生物模型

在模型生物体中测试的原理与细胞系的原理相同。测试CRISPR/Cas9系统和sgRNA的最佳方法是通过电穿孔或微注射将复杂的sgRNA和Cas9送入胚胎。你不一定要用质粒载体。例如,在小鼠胚胎中,你不需要将sgRNA克隆到质粒系统中。您可以使用Cas9 mRNA或蛋白与您的sgRNA。在Cas9和sgRNA分娩后,培养你的胚胎到一个阶段,你有足够的DNA产量提取。在小鼠中,通常是5天培养到囊胚阶段。从胚胎中提取DNA,然后使用T7E1内切酶检测。或者,您可以使用桑格测序。测试sgRNA的效率相对容易在实验室实现。虽然在线预测工具正在改进,但对sgRNA的实际测试确保了编辑成功的最佳机会。

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