当前位置:生物帮 > 热点关注 > 产品&技术 > 正文

AAV病毒包装

标签: AAV病毒 包装
摘要 : (一) AAV-293细胞的冻存 (二)AAV-293 细胞的传代 (三)AAV-293 细胞的复苏 (四)AAV包装和浓缩
(一) AAV-293细胞的冻存
随着传代的次数增加,AAV-293 细胞会出现生长状态下降、突变等。为了防止此类现象的出现,我们需要在开始就对细胞进行大量冻存,以保证实验的稳定性和持续性。在细胞对数生长期进行冻存,增加细胞复苏成活率。
1、去掉细胞培养上清液,加入PBS 洗去残留的培养基;
2、加入0.25%的胰酶,消化1~2min 后,镜下观察细胞变圆,细胞间间隙加大时,去除胰酶,加入新鲜培养基吹打混匀,移入离心管中。
3、细胞计数,将细胞全部晃下,加入 3mL 37 ℃ 预热的 10% DMEM,用 10mL 移液管进行吹打,较大力吹打 6-8 次即可,不留死角,之后,将所有细胞吸出,置于15mL 离心管中,取 50ul 混匀后的细胞于 1.5mL eppendorf 管中,加入 450ul 10% DMEM,即为 10 倍稀释,混匀,取 10ul 细胞于计数板中计数。计数板上共 4 大格,每大格 16 小格。计数时,4 大格均计数,总数除以 4(得每大格细胞数),再乘以 10(10 倍稀释),即为实际 n 万/mL 细胞浓度。
4、细胞离心,1000 rpm/min,5min。去掉上清。
5、根据细胞计数结果加入细胞冻存液(70%完全培养基+20%FBS+10%DMSO)重悬细胞,密度为3 x 106 个/ml。
6、分装进细胞冻存管,放入冻存盒中,放入-80℃超低温冰箱。
7、第二天将细胞放于液氮罐中长久保存,并作记录。保存过程中,要不时复苏细胞检测细胞存活率,观察细胞状态等。
(二)AAV-293 细胞的传代
当细胞生长到汇合率达到 80%~90%时需要对细胞进行传代操作,以扩大细胞数量,维持细胞良好的生长状态。
1、消化细胞,方法同细胞冻存。
2、细胞离心结束后,加入完全培养基重悬。
3、根据具体情况,将细胞分到10cm 培养皿中,每个培养皿补足到10ml 培养基。
(三)AAV-293 细胞的复苏
当细胞传代次数过多,细胞状态变差时,或者细胞出现污染事故时,需要丢弃并对最初冻存的细胞进行复苏。
1、设置温度为37~42℃的水浴。
2、查看细胞库记录,根据记录从液氮罐中取出冻存的细胞(需戴上棉手套,防止被冻伤),迅速丢入水浴锅中并快速晃动,尽量在1~2min 内使细胞溶液完全
溶解。
3、将细胞溶液转移到15ml 离心管中,并在其中加上1ml 新鲜的完全培养基,混匀后离心,1000 rpm/min,5min。
4、去掉上清,加入5ml 新鲜的完全培养基,混匀沉淀后,转入6 cm 培养皿。
5、将培养皿平稳放入37℃、5% CO2 和95%相对湿度的培养箱中培养。
6、第二天观察细胞存活率。给细胞换一下培养基。以后每天观察细胞生长情况。
(四)AAV包装和浓缩
1. 质粒扩增
构建好的AAV载体、包装质粒和辅助质粒需经过大量抽提, 浓度大于1ug/ul,A260/280 在1.7-1.8 间方可用以包毒。推荐使用Qiagen 大抽试剂盒进行质粒的大量去内毒素抽提。
2. 传AAV-293细胞
将培养AAV-293 细胞T75 瓶中的培养基吸净,加入2mL 4 度冰箱取出的0.25%胰酶,使其均匀覆盖瓶底,置于37 度培养箱中3-5min,取出,摇晃可发现细胞于底部脱离,将其全部晃下,加入3mL 37 度水浴中预热的10% DMEM,移液枪用10mL 移液管进行吹打,较大力吹打6-8 次即可,不留死角,瓶口处较难吹打可将移液管对准培口,小力将培养基打出即可覆盖到接近瓶口的细胞。之后,将所有细胞吸出,置于15mL 离心管中,取50ul 混匀后的细胞于1.5mL eppendorf 管中,加入450ul 10% DMEM,即为10 倍稀释,混匀,取10ul 细胞于计数板中计数。计数板上共4 大格,每大格16 小格。计数时,4 大格均计数,总数除以4(得每大格细胞数),再乘以10(10 倍稀释),即为实际n 万/mL 细胞浓度。传代当天记为第一天,若第二天进行转染,铺900-1000 万/T75;若第三天转染,铺350-400 万/T75。每瓶T75 加10mL 10%DMEM 培养基。转染当天观察细胞密度,80-90%满即可进行转染。转染前无需换培养基。
3. 做脂转complex
试剂名称 试剂数量
载体质粒 5ul(1.0ug/ul)
包装质粒 5ul(1.0ug/ul)
辅助质粒 5ul(1.0ug/ul)
 
 
 
注:LipofiterTM转染试剂为汉恒生物产品,使用说明参考LipofiterTM说明书。
4. AAV 病毒收毒:
病毒颗粒同时存在于包装细胞和培养上清中。可以将细胞和培养上清都收集下来以获得最好的收率。
1) 准备一个干冰乙醇浴(将乙醇倾入装有干冰的泡沫盒即可,也可用液氮替代干冰乙醇浴)和37°C 水浴;
2) 将产毒的细胞连同培养基一同收集到一个15ml 的离心管中。收集细胞时,将培养盘倾斜一定角度将细胞刮到培养基中;
3) 1000 rpm/min,离心3 分钟,分离细胞和上清,将上清另外存放,细胞用1ml PBS 重悬;
4) 将细胞悬浮液在干冰乙醇浴和37°C 水浴中反复转移,冻融四次。每次融解后稍加震荡。注意:每次凝固和解冻大概需要十分钟的时间。
5. AAV 病毒浓缩:
1) 10,000 g 离心去除细胞碎片,将离心上清转移到一个新离心管中。
2) 将两次收集的上清混合在一起,用 0.45um 滤器过滤除杂质
3) 加入 1/2 体积的 1M NaCl,10% PEG8000 溶液,混合均匀,4度过夜
4) 12,000 rpm 离心 2h,弃上清,病毒沉淀用适量的 PBS 溶液溶解,待完全溶解后 用 0.22um 滤器过滤除菌。
5) 加入 Benzonase 核酸酶消化去除残留的质粒DNA(终浓度为50 U/ml)。合上管盖,颠倒几次以充分混合。在37 °C 孵育30 分钟;
6) 用 0.45 μm 过滤头过滤,取滤出液,即为浓缩的AAV病毒。
6. AAV的纯化
1) 向病毒浓缩液中添加固体 CsCl 直到密度为1.41 g/ml(折射率为1.372);
2) 将样品加入到超速离心管中,用预先配好的 1.41 g/ml CsCl 溶液将离心管剩余空间填满;
3) 在 175,000 g 下离心24 小时,以形成密度梯度。按顺序分步收集不同密度的样品,取样进行滴度测定。收集富集有AAV 颗粒的组分;
4) 重复上述过程一次。
5)将病毒装入100 kDa的透析袋,4度透析脱盐过夜。此即为纯化的AAV病毒
AAV病毒包装滴度测定(采用 Q-PCR 法)
1)取 20ul 浓缩病毒液,加入 1ul RNAse-free DNAse,混匀,37℃水浴反应30min。
2)4℃,12 000 rpm/min,离心 10 min,取 10ul 上清到另一个无菌的 1.5ml EP 管 中。
3)加入 90ul Dilution Buffer(1 mM Tris-HCl, pH 8.0,0.1 mM EDTA,150 mM NaCl),混匀,37℃金属浴反应 30min。
4)自然冷却至室温,加入 1ul 蛋白酶 K,65℃水浴反应 1h。
5)100℃金属浴反应 10min,自然冷却至室温。
6)进行 Q-PCR 检测滴度。
AAV病毒的储存、稀释
1. 病毒的储存:
收到病毒液后在很短时间内即使用腺相关病毒进行实验,可以将病毒暂时放置于 4℃保存;如需长期保存请放置于-80℃(病毒置于冻存管,并 使用封口膜封口)。
1)病毒可以存放于-80℃ 6 个月以上;但如果病毒储存时间超过 6个月,建议在使用前需要重新测定病毒滴度。
2)反复冻融会降低病毒滴度:每次冻融会降低病毒滴度10%;因此在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融,为避免反复冻融,建议收到病毒后按照每次的 使用量进行分装。
2. 病毒的稀释:
如果需要稀释病毒,请将病毒取出置于冰浴融解后,使用 PBS 缓冲液或培养目的细胞无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)。混匀分 装后 4℃保存(请尽量在三天内用完) 分装后使用。
AAV使用安全注意事项
1.病毒操作时最好使用生物安全柜。如果使用普通超净工作台操作病毒,请不 要打开排风机。
2.病毒操作时请穿实验服,带口罩和手套。
3.操作病毒时特别小心不要产生气雾或飞溅。如果操作时超净工作台有病毒污染,请立即用 70%乙醇加 1% SDS 溶液擦拭干净。接触过病毒的枪头、离心管、培养板、培养液等请用 84 消毒液或 1% SDS 中浸泡过夜后弃去。
4.用显微镜观察细胞感染情况时应遵从以下步骤:拧紧培养瓶或盖紧培养板。 用 70%乙醇清理培养瓶外壁后到显微镜处观察拍照。离开显微镜实验台之前,用70%乙醇清理显微镜实验台。
5.如需要离心,应使用密封性好的离心管,或者用封口膜封口后离心,而且尽 量使用组织培养室内的离心机。
6.脱掉手套后,用肥皂和水清洗双手。

作者:汉恒生物 点击:

    热门文章TOP