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你的细菌培养物还在增长吗?引物在OD­600进行测量

这篇文章是写给那些想知道“我怎么知道我的细菌培养什么时候‘完成’了?”我什么时候可以收获我的细胞?

细菌生长曲线综述

让我们先回顾一下细菌生长曲线的4个基本阶段:log阶段,滞后阶段,静止阶段和死亡阶段(图1)。在此期间,细胞正在适应和调整他们的新环境。然后,培养进入对数期,在此期间,细胞迅速分裂,数量翻倍(大肠杆菌在对数期每20分钟翻一番)。当你在液体培养液中达到最大的细胞密度时,细胞就进入了静止期。在这一阶段,细胞数量没有整体增加——死亡的细胞被新分裂的细胞所取代,但活细胞的总数保持不变。如果你在研究孢子形成细菌,这可能是营养细胞孢子形成的阶段,或形成新的孢子。最后,死亡(或下降)阶段是由多种因素引起的,包括营养或氧气的缺乏,细胞代谢引起的介质pH值的变化,或有毒细胞废物的积累。

使用OD600确定您的文化处于什么阶段

最简单的方法是测量OD600,或600纳米的光密度,来测量一个培养基在其生长曲线上的距离。这种波长是专门为细菌OD测量而选择的,因为与紫外线波长不同,600nm对培养物无害。这种波长通常也不会被像TSB和LB这样的黄色介质吸收。通过监视OD600的增长速度,您可以确定培养物的滞后、记录和固定相。

那么如何测量呢?对于一个简单的悬浮在液体中的细胞,你首先需要零或“空白”的分光光度计与新鲜的,未接种的媒介减去媒介对测量的任何吸收贡献。然后,取您的文化样本并测量OD600。这种测量方法可以很容易地计算出培养瓶中每毫升培养细胞的总数。还不错吧?尽管如此,还是有一些事情需要注意:

当你提取一个培养基样本时,确保你混合的很好,并立即进行测量,因为细胞可以在一分钟左右的时间内开始沉淀,这将导致不准确的结果。

如果细菌在溶液中形成生物膜或聚集物,这将严重影响测量的准确性和精度。在这种情况下,您可能需要对培养物进行声波降解或进一步处理,以分解这些“簇”。查阅有关您正在使用的菌株的文献,以避免或消除这个问题。

最重要的是,>1的OD值不准确!这样高的OD读数超出了大多数分光光度计的动态范围,这意味着这些读数不会随着细胞浓度的增加而线性增加。如果你得到的OD值大于1,稀释你的样品2倍或更多直到它达到OD600 < 1。

如果你经常用烧瓶培养细菌,训练自己用眼睛估计OD值是有帮助的。这样,当烧瓶明显不在您正在寻找的OD范围内时,跳过OD600检查可以节省宝贵的时间。查看本文了解更多信息,并考虑使用微板阅读器来提高OD测量的吞吐量。

其他监测生长和代谢的方法

虽然使用一种培养物的OD600来监测生长是一种久经考验的真实方法,但是还有其他几种方法来评估细菌培养物的生长和代谢。您可能会发现其中一些因素对于您的特定应用程序也更相关或有用!

通过采集培养物的样本并在显微镜下进行检查,你可以开始对培养物中活细胞的近似浓度有一个了解。额外的好处:你可以比较细胞的图片,看看是否有不同的形态学批次,或多少营养细胞在一个孢子形成培养。

溶解氧和二氧化碳。考虑啤酒(由酵母制成),康普茶(由酵母和各种细菌制成),以及其他由微生物发酵的饮料。在这些例子中,随着发酵的进行,氧气(O2)被消耗,二氧化碳(CO2)被形成。同样的过程发生在有氧培养的细菌培养中!溶解O2和CO2探头是生物反应器中常用的探头。如果你想要一个微创的选择,光学传感器(和补丁)存在,使用LED荧光监控溶解­2从外面瓶啊!

大多数细菌随着时间的推移会降低培养基的pH值,包括大肠杆菌。对于某些物种来说,酸的产生实际上会限制一个文化的最大生长和生存能力。与氧传感器一样,有方法可以对烧瓶中的pH值进行无创连续监测。

糖的分析。有了某些仪器,从生长培养基中快速可靠地测定残余糖分是可能的。例如,如果你的培养基中主要的碳源是葡萄糖,在细菌生长的中途获取葡萄糖测量数据可以让你了解培养基在生长曲线中的位置。

那么你应该在什么时候收获一种文化呢?

简而言之,这完全取决于文化的最终目标是什么。例如,我曾经大量培育和诱导大肠杆菌过度表达非本地蛋白,然后从培养中纯化。我经常发现,我从培养物中获得的蛋白质的质量和数量取决于我收获时的相细胞。然而,在其他情况下,目标只是尽可能多的获取细胞。

一旦你知道了需要采集细胞的特定生长阶段,一定要进行一些测试(包括测量),以确保你对细菌生长时间的评估是正确的。这将给你一个强烈的感觉,你的文化需要多长时间准备收获,并提供历史数据比较增长曲线。始终从一个较小的“种子”文化开始,以获得可靠的和持续增长的烧瓶。最后,如果你不太适应减少污染的风险,可以测试你的细胞培养技术几次。

从相对简单的OD测量到代谢物分析,有很多方法可以监视实验室中正在生长的细菌。由于生长阶段对文化有很大影响,知道如何准确测量这个参数是任何细菌实验室的关键技术!

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