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子孢子肝浸润抗体

脊椎动物宿主的疟疾感染始于被感染的蚊子在皮肤中沉积孢子。然后孢子虫进入循环,通过孢子虫表面的周孢子虫蛋白(CSP)和肝窦的糖胺聚糖(GAGs)之间的强相互作用迅速捕获肝窦。子孢子虫CSP最初与肝脏GAGs结合是在肝细胞的基底外侧首次报道的(Frevert et al, 1993;Cerami等人,1994)。后续研究确定,孢子虫CSP与星状细胞合成的GAGs结合,并通过内皮腔隙向血管腔内突出(Pradel等人,2002)。这种相互作用不是宿主细胞识别的义务(Frevert et al, 1996)。微观研究表明,孢子虫离开循环主要是通过穿越库普弗细胞(Meis et al, 1983, 1985;Vreden,1994;Pradel和Frevert等人,2001)是窦状衬里的一部分,随后是潜在肝细胞的感染(Frevert等人,2005)。在随后的一项研究中,使用了细胞内共聚焦显微镜和在内皮细胞中表达GFP的转基因小鼠细胞系,这为孢子虫也能通过内皮细胞离开循环提供了证据(Tavares et al, 2013)。最近,Kupffer细胞CD68被鉴定为孢子体受体,提示优先孢子体与Kupffer细胞相互作用的分子基础。在cd68敲除小鼠中,与野生型小鼠相比,小鼠肝脏入侵减少了70%以上(Cha et al, 2015)。

CD68作为子孢子体受体的鉴定来源于从噬菌体文库中筛选出的三种肽- p39、P61和p52 (Cha et al ., 2015)。这些肽不仅选择性地与库普弗细胞表面结合,而且重要的是,它们还竞争性地抑制了库普弗细胞进入和进入肝实质。进一步的实验表明,这些肽与库普弗细胞表面的CD68蛋白结合,是孢子虫表面GAPDH疟原虫(pGAPDH)的mimotopes(结构模拟物)。CD68和pGAPDH直接相互作用,这种相互作用对于库普弗细胞的孢子虫遍历至关重要(Cha et al, 2016)。

GAPDH除了在糖酵解中起主要作用外,还被认为是候选疫苗,因为它发生在几种致病性微生物的表面,作为宿主细胞识别和侵袭的配体(Pancholi & Fischetti et al, 1992, 1997;Argiro等人,2000;Rosinha等人,2002;Bergmann等人,2004;Boel等人,2005)。由于GAPDH在进化过程中是保守的,而且它的氨基酸序列在病原体和高等生物之间高度相似,因此使用全蛋白作为疫苗抗原是不现实的。因此,确定能够诱发保护性抗体产生的寄生虫gap - dh特异性抗原表位是一个重点(Perez-Casal & Potter, 2016)。我们的研究表明,用klh标记的P39肽(a GAPDH mimo墙面)免疫小鼠,可以获得较强的保护免疫,而抗P39血清可以识别pGAPDH蛋白。在此,我们报道了使用抗p39抗体来鉴定作为保护性表位的berghei GAPDH (PbGAPDH)的结构域的表位定位方法。我们表明,PbGAPDH特有的保护性表位位于蛋白质的c端,预测位于折叠蛋白质的暴露口袋中。

结果

mimo墙面多肽P39、P61和P52作为免疫原性抗原以保护P berghei孢子虫感染的评估

通过噬菌体展示肽库,我们已经发现了三个肽- p39, P61和p52 -它们与库普弗细胞结合,并通过这种方式强烈抑制子孢子结合和进入(Cha et al ., 2015)。我们还发现,P39肽免疫可以有效保护小鼠免受蚊虫叮咬引起的P berghei孢子虫感染。图1A证实了该抗p39抗体能够识别与GAPDH具有相同流动性的孢子虫蛋白。然而,另外两种肽p61和p52还没有被鉴定出来。我们用klh标记合成的mimo墙面多肽免疫小鼠。所有三个肽的抗体都能识别重组的pGAPDH(图1B)。然而,每个肽似乎都模拟了不同的PbGAPDH表位(图1C)。接下来,我们评估了每个候选mimo墙面抗原的免疫原性和保护潜力。用三种mimo墙面抗原的单一或不同组合免疫小鼠。而各组总抗体浓度无显著差异,P39特异性免疫原性明显高于P52(图2A)。每次免疫接种后,由两只被感染的按蚊叮咬后对P贝氏孢子虫进行挑战。与klh免疫组相比,P39肽段免疫保护效果最强,67%抑制子孢子虫感染(图2B)。这些初始数据表明P39具有最强的保护电位,因此,它被用于后续的所有实验。

(A)抗p39抗体在P berghei孢子虫裂解物的Western blots中特异性识别PbGAPDH。以Ponceau染色和抗肌动蛋白抗体作为负载对照。“S”:从被感染的斯蒂芬尼斯唾液腺中纯化的孢子虫的裂解物;“M”:从未感染的斯蒂芬尼斯唾液腺中提取的假lysates。抗csp抗体作为孢子虫裂解液的阳性对照。一种多克隆抗pbgapdh抗体(红色箭头)识别出与抗p39条带具有相同移动性的孢子虫GAPDH条带。(B)针对每一个mimo墙面多肽(P39, P61和P52)的抗体识别具有相同流动性的条带为PbGAPDH(红色箭头),而不是pET标记蛋白(蓝色箭头)。每个面板显示两个通道,左边仅包含pET标记蛋白,右边是标记的重组PbGAPDH蛋白。用于检测印迹的抗体显示在每个面板底部。抗标记和抗klh抗体分别作为阳性和阴性对照。用抗小鼠GAPDH抗体作为阳性对照,鉴定GAPDH蛋白。重组蛋白和标记蛋白的位置由右侧箭头指示。所有的数据都代表了两个独立的实验。(C)每个抗肽抗体都明确识别其自身的肽。显示在每个面板顶部的生物素化肽与链霉亲和素涂层的ELISA板的孔结合,并被每个面板底部的抗体结合测试。没有发现交叉反应的证据。所有数据都代表两个独立的化验。

mimo墙面多肽作为保护P·伯格伊感染的抗原的评估。

(一)肽免疫原性。小鼠免疫与单一抗原(50μg KLH-conjugated肽),结合两个抗原(25μg每个),或三种抗原的结合(16.7μg每个),表示。每隔2周注射三针后,用ELISA法测定每只小鼠产生的特异性抗体数量。顶部面板:总抗体浓度。每组小鼠的数量用括号表示。底部面板:特定抗体浓度。所有的数据都代表了两个独立的实验。错误条表示SD。(B)肽免疫预防感染。接种疫苗的小鼠受到两只被感染的史蒂芬尼蚊子的叮咬。用薄血涂片和姬姆沙染色法测定感染的流行程度,直到感染后12天。被感染小鼠的数量/被感染小鼠的数量和%的抑制在每个面板的底部。数据来自三个(单个抗原)或四个(混合抗原)独立实验。P值(*P < 0.05);* * P < 0.01;***P < 0.001)采用单因素方差分析(A)或Mann-Whitney U检验(B)计算,(A)每组小鼠数与(B)每组小鼠数相同。

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