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RNA琼脂糖凝胶电泳实验操作步骤与注意事项

标签: RNA电泳
摘要 : 1%的RNA琼脂糖凝胶电泳可以用来检测RNA的完整性,本实验的主要目的是熟悉植物总RNA非变性胶电泳操作原理和操作方法与步骤。

1%的RNA琼脂糖凝胶电泳可以用来检测RNA的完整性,本实验的主要目的是熟悉植物总RNA非变性胶电泳操作原理和操作方法与步骤。

一、实验目的

掌握植物总RNA非变性胶电泳的原理和方法。

二、实验原理

RNA电泳可以在变性及非变性两种条件下进行。非变性电泳使用1.0%--1.4%的凝胶,不同的RNA条带也能分开,但无法判断其分子量。只有在完全变性的条件下,RNA的泳动率才与分子量的对数呈线性关系。因此要测定RNA分子量时,一定要用变性凝胶。在需快速检测所提总RNA样品完整性时,配制普通的1%琼脂糖凝胶即可。

RNA琼脂糖凝胶电泳实验操作步骤与注意事项

三、实验材料、器具及药品

蘑菇的总RNA溶液。 电泳仪,电泳槽,电子天平,移液器,枪头,微波炉,紫外透射检测仪等。 琼脂糖,1XTAE电泳缓冲液,0.5μg/ml溴化乙锭(EB)10X载样缓冲液。

四、实验步骤

(1)用1×TAE电泳缓冲液制作琼脂糖凝胶,加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶。

(2)在超净工作台上,用移液器吸取总RNA样品4μl于封口膜上。在实验台上再加入5μl 1×TAE电泳缓冲液及1μl 的10X载样缓冲液,混匀后,小心加入点样孔。

(3)打开电源开关,调节电压至100V,使RNA由负极向正极电泳,约30min后将凝胶放入EB染液中染色5min,用清水稍微漂洗。在紫外透射检测仪上观察RNA电泳结果。

RNA琼脂糖凝胶电泳实验操作步骤与注意事项
 
RNA琼脂糖凝胶电泳实验操作步骤与注意事项

RNA的变性琼脂糖凝胶检测

试剂:

(1)MOPS缓冲液(10*):0.4mol/L 吗啉代丙烷磺酸(MOPS) (Ph7.0),0.1mol/L NaAc, 10mol/L EDTA。

(2)上样染料:50%甘油,1mmol/L EDTA ,0.4%溴酚蓝,0.4%二甲苯蓝。

(3)甲醛。

(4)去离子甲酰胺。v电泳槽清洗:去污剂洗干净(一般浸泡过夜)——水冲洗——乙醇干燥——3%H2O2灌满——室温放置10分钟——0.1%DEPC水冲洗。

操作:

(1) 将制胶用具用70%乙醇冲冼一遍,晾干备用。

(2) 配制琼脂糖凝胶。

①称取0.5g琼脂糖,置干净的100ml 锥形瓶中,加入40ml蒸馏水,微波炉内加热使琼脂糖彻底溶化均匀。

②待胶凉至60--70 ℃,依次向其中加入9ml 甲醛、5ml 10X MOPS缓冲液和0.5ul 溴化乙锭,混合均匀。

③灌制琼脂糖凝胶。

(3) 样品准备:

① 取 DEPC处理过的500ul小离心管,依次加入如下试剂: 10x MOPS缓冲液2ul,甲醛3.5ul,甲酰胺(去离子)10ul,RNA 样品 4.5ul,混匀。

② 将离心管置于60℃水浴中保10分钟,再置冰上2分钟。

③ 向管中加入3ul 上样染料,混匀。

(4)上样。

(5)电泳:电泳槽内加入1XMOPS缓冲液,于7.5V/ml 的电压下电泳。

(6)电泳结束后,在紫外灯下检查结果。

小结:RNA琼脂糖凝胶电泳中务必去除RNASE酶的污染,所有的试剂需用DEPC水配制,所用的器材也要的DEPC处理并灭菌,防止RNA被降解。

作者:青岚 点击:

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