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OPTI-MEM进行贴壁细胞培养的实验方法

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摘要 : 无血清培养基可以提供细胞贴壁需要的一些基质,本文总结了利用无血清培养基OPTI-MEM进行贴壁细胞的脂质体转染试验材料,步骤、个人经验以及问题分析。

无血清培养基可以提供细胞贴壁需要的一些基质,本文总结了利用无血清培养基OPTI-MEM进行贴壁细胞的脂质体转染试验材料,步骤、个人经验以及问题分析。

贴壁细胞的脂质体转染

一、实验材料

1、宿主细胞CHO(贴壁细胞)

2、脂质体LIPOFECTAMINE 2000(invitrogen公司)

3、6孔细胞培养

4、无血清培养基opti-MEM(GIBICO)

5、转染级质粒

二、实验步骤

invitrogen的LIPOFECTAMINE 2000说明书上列举了24孔、12孔、6孔......板的实验体系,因为需要转染的细胞量大,所以一直采用的是6孔版做的转染。以下是以6孔板为例说明一下我的体系和方法吧!

1、转染前一天,以合适的细胞密度接种到6孔培养板上。(我的接种密度是3~4*105/ml.)转染时,细胞要达到90~95%的融合。

2、溶液1:240ul 无血清培养基 + 10 ul lipofectamine 2000 per well (总体积250 ul)(温育5min)

3、溶液2:X ul 无血清培养基 + 4 ug 质粒 per well(总体积250 ul)

4、将溶液1与溶液2混合,室温下置20min。

5、与此同时,将6孔板中的细胞用无血清培养基冲洗细胞两遍后,加入2ml 无血清培养基。

6、将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入孔中,摇动培养板,轻轻混匀。在37℃,5%的CO2中保温5~6小时。

7、6小时后,更换含有血清的全培养基,在37℃,5%的CO2中48~72h检测转染水平。

8、如果做稳定转染,换全培养基培养后24h,即可以1:10或更高的稀释比例(根据细胞的生长情况)接种到新的培养板,加抗生素进行筛选。

三、个人经验:

我觉得贴壁细胞的脂质体转染还是很容易的,有了经验之后,现在做转染得心应手,转染前后细胞的形态几乎不发生变化,几乎没有细胞死亡。转染率很高。以下是个人经验,与大家分享。

1.细胞的状态。这点非常重要,不要急于求成,一定要让细胞处于最佳的生长状态再做。有文献说传代不要超过17代。我总是在细胞复苏后的3代左右做,那时细胞状态最好,不要用传了很多代的细胞去做,细胞的形态都会发生变化了。

2.细胞的融合度。细胞的融合度必须要达到90%才能做,细胞太少,容易死的。

3.无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO)很好用,有条件的话,就用它代替PBS洗细胞两遍(我曾比较过OPTI-MEM与PBS或无血清的 DMEM,前者的转染效率确实高)。注意洗的时候要轻,靠边缘缓缓加入液体,然后不要吹吸细胞,而是转动培养板让液体滚动在细胞表面。如果洗的太厉害,细胞又损失一部分,加了脂质体后,细胞受影响就更大了,死亡细胞会增多。

4.加入无血清培养基后5~6小时更换全培养基。无血清培养基培养时间过长,对细胞是有毒性的,这里有血的教训!

5.转染的质粒一定纯度好、浓度高、无内毒素。浓度不要低于0.35ug/ul。低浓度的质粒,我做的结果都不好。

6.48小时mRNA表达最高;72h蛋白表达最高。

加转染试剂(Opti-MEM I),细胞就浮起或死亡问题分析?

各位前辈:我想把microRNA转到成纤维细胞内,用的是GIBCO(tm) Opti-MEM I Reduced-Serum Medium (1X)和Lipofectamine™ 2000转的。现在的问题是一加转染试剂细胞就大量死亡。Opti-MEM和冲洗用的PBS都37度预热过的。甚至我用无血清的DMEM对照也大量死亡。有时细胞死亡稍微好点,是不是和细胞批次关系更密切,还是有其他原因。

我的实验操作 :

1 10%血清DMEM接种细胞在24孔板,长至30~50%满底时进行转染。

2 lipofectamine2000 0.5ul稀释于25 ul Opti-MEM I Reduced-Serum Medium (1X) (GIBCO)静置5分钟

3 microRNA 10pM 稀释于25 ul Opti-MEM

4 混匀2和3,加Opti-MEM至500ul。室温静置30min。

5 用PBS(室温)轻轻冲洗培养空,镜下观察部分细胞略变圆(或有变圆倾向),但没什么细胞浮起。吸去PBS,轻轻加入2和3的混合物。镜下观察,即刻细胞大量浮起,或细胞挛缩,有细胞死亡倾向。6h后证实细胞大量死亡。但有细胞干死在培养皿底的印迹。不同批次的细胞,死亡情况略有不同。

问题分析:

1.不是说明书上说什么你就做什么,你是有自主意识的。

2.你的细胞加opti-MEM就不好有两种可能:a。你养的细胞有问题,或者有共生菌,改变培养条件就可能爆发;b。你的细胞对opti-MEM敏感。为什么一定要用opti?你没有自己的主见吗?

3.你的转染有问题。从你的描述来看,你并不是接种后24hr左右立即做转染,而是让它长到50%左右,也就是如果不到50%,你也许会长更久,对吗?——这是转染实验的大忌,超过24hr细胞对转染会不敏感,转染效率下降。

4. 你转染时选择的细胞丰度也没有太大的问题,但是这个也是具体问题具体对待。像HeLa是绝对要30%左右的,就是这样48hr后,细胞已经铺得密密麻麻;就不要想95%了,那样的细胞只能扔掉,一天换几次新鲜的培养基也跟不上培养基变黄的速度。需要参考的东西包括你细胞原本的生长速度,对lipo2K的敏感程度(被抑制和毒死的情况,我可以负责任的告诉你lipo2K非常毒,他们的lipo2K是稀释到33%的产品,他们100%的lipo2K CD是另卖的,其中原因之一就跟毒性有关,没有多少细胞能耐受),总之要确保你的细胞在24hr长到合适的浓度做转染,转染40-48hr后铺满孔,或多或少一点点也可。

5. 由于lipo2K毒性很高,如果实在不合适,你应该考虑更换其他的转染试剂;此外,应该用你的平时养细胞的培养基做转染,不过记得去除抗生素,另外稀释lipo2K和质粒的培养基要去血清去抗生素的。

6.无血清细胞处于一种应激状态,本来就长不好,这时候你投毒,当然更差。lipo2K不是不计较培养基是否有血清吗,所以在“双无”培养基稀释lipo2K 和RNA,形成复合物后可以投到含血清的无抗生素的培养基中。实际上我们转染用的培养基,double血清含量(普通5%,转染用10%)。早期lipo 的说明书要求“双无”,3hr后添加double血清培养基。实际操作发现,也可以直接投入double血清培养基中。

7.无抗生素的原因是,细胞膜被穿孔,抗生素进入直接杀细胞。

经验推荐:OPTI-MEM与PBS和无血清的 DMEM培养基相比较,Life Tech 的GIBICO无血清培养基OPTI-MEM的转染效率比较高,不妨试下。



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作者:青岚 点击:

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