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几种细胞培养基M199中维生素含量的测定方法

摘要 : 本文建立了反相色谱法同时测定细胞培养基M199中维生素A、维生素E醋酸酯、维生素D2的含量的方法。采用Lichrospher C18,5μm,225×4mmid柱,可变波长UV检测器,甲醇为流动相,样品在10分钟内达到了基线分离。该方法简便、快速,结果可靠,可用于细胞培养基的质量控制。

细胞培养基作为细胞工程重要的原材料,其品质的优劣直接影响到生物制品的质量,是生物制品企业非常重视的基础原料。而细胞培养基中含有氨基酸、维生素等必需的营养物质,它们是维持和促进细胞生长、增殖的主要因素。这些物质含量的多少、是否符合规定已成为衡量细胞培养基质量的重要指标。其中的某些维生素成分如维生素A、维生素E、维生素D2等对空气、光照和热极不稳定,且在培养基中的含量极少,是细胞培养基质量稳定性的重要影响因素。在细胞培养基M199中这三种维生素组分的含量在0.01μg/ml~0.14μg/ml之间,参考已报道的文献,脂溶性维生素的测定大都是含量较高的复合制品,而从含有61种成分的M199细胞培养基中提取这三种维生素并进行测定还未见报道[1~4]。由于这三种维生素的含量极低,在同一波长下难以同时测定三种组分,因此,我们采用可变波长UV检测器,利用多波长切换来分别测定VA、VD2和VE,以提高检测灵敏度,获得了良好的结果。

1实验部分

1.1 仪器和试剂:HP1050型高效液相色谱仪包括:HP 四元梯度泵、HP自动进样器、HP 可变波长紫外检测器、HP Pheonix Dos化学工作站;分析天平BS210S,赛多利斯;旋转蒸发器RE-52AA,上海亚荣生化仪器厂;维生素A醋酸酯、维生素D2、维生素E醋酸酯均为sigma试剂;甲醇为色谱纯;氯仿、异丙醇为分析纯。细胞培养基M199,无锡市美迪生物制品有限公司。

1.2 色谱条件:色谱柱:Lichrospher C18,5μm,225×4mmid;流动相:甲醇;流速: 1.0ml/min,柱温控制:40℃;进样量:30μl;波长切换程序:时间0.0~6.0min 检测波长320nm,时间6.0~8.5min 检测波长265nm,时间8.5~10.0min 检测波长295nm。

1.3 标准品溶液:精密称取维生素A醋酸酯、维生素D2、维生素E醋酸酯适量,用异丙醇溶解并稀释至下列浓度:维生素A醋酸酯1.4μg/ml、维生素D2 1.0μg/ml、维生素E醋酸酯0.1μg/ml,作为标准品溶液。

1.4 样品制备:取M199细胞培养基5g,精密称定,置250ml分液漏斗中,加入50ml纯化水完全溶解;加入氯仿振摇萃取,萃取5次,每次加入氯仿20ml;合并氯仿层放入250ml旋转烧瓶中,置旋转蒸发器上旋转蒸发至干(﹤35℃),精密量取5.00ml异丙醇至烧瓶中溶解残渣,溶液即为供试品溶液。

2结果与讨论

2.1 色谱分离:根据1.2色谱条件进行色谱分离试验。结果表明,该条件下10分钟内可以有效的使维生素A醋酸酯、维生素D2、维生素E醋酸酯三种组分达到基线分离。

2.2 线性关系:分别取维生素A醋酸酯、维生素E醋酸酯和维生素D2标准品溶液0、1、2、2.5、3ml,置10ml容量瓶中,用异丙醇稀释至刻度,摇匀。按上述色谱条件,分别进样30μl,计算浓度C(μg/ml)与峰面积(A)之间的线性回归方程:维生素A醋酸酯 A=96.95C-1.76,R=0.9998;维生素D2 A=62.83C-0.45,R=0.9998;维生素E醋酸酯 A= 13.09C+0.20,R=0.999;结果表明,维生素A醋酸酯在0.14~0.42μg/ml、维生素E醋酸酯在0.01~0.03μg/ml、维生素D2 0.1~0.3μg/ml内,与峰面积有良好的线性关系。

2.3 精密度试验:分别取标准品溶液的1ml稀释液,重复进样6次,计算峰面积的相对标准偏差,RSD(n=6)分别为:维生素A醋酸酯1.45%、维生素D2 1.31%、维生素E醋酸酯3.17%,精密度良好。

2.4 回收率试验:在样品中加入三种组分,按上述色谱条件测定维生素A醋酸酯、维生素D2、维生素E醋酸酯的回收率,平均回收率为95.9%~100.8%,见表1

2.5 样品测定:取三批样品适量,精密称定,按1.4样品溶液制备方法制备供试品溶液,进样量30μl测定峰面积,按外标法计算样品含量,结果见表2

2.6 讨论

维生素A醋酸酯、维生素D2、维生素E醋酸酯的紫外最大吸收波长分别为320nm、265nm和295nm;由于三种组分在细胞培养基中含量都极小,浓度分别为0.14μg/ml、0.10μg/ml和0.01μg/ml,故本法采用多波长切换来进行测定,以提高检测灵敏度;另外细胞培养基成分非常复杂,给脂溶性维生素分离带来相当大的困难,我们在样品前处理时采用了溶媒萃取法;上述两个原因给分析测定带来一定的偏差。由于这三种脂溶性维生素对光、热、空气极不稳定,故我们可以通过测定这三个组分的含量来反映细胞培养基的质量稳定性。本法较好的测定了细胞培养基M199中脂溶性维生素的含量,为细胞培养基的质量控制提供了检测手段。

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