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高效液相色谱实验中常见问题分析

摘要 : (一)保留时间变化(二)保留时间缩短(三)保留时间延长(四)出现肩峰或分叉(五)鬼峰(六) 基线噪声(七)峰拖尾(八)峰展宽

(一)保留时间变化

1.柱温变化 柱恒温,必要时需配置恒温箱;

2.等度与梯度间未能充分平衡 至少用10倍柱体积的流动相平衡柱;

3.缓冲液容量不够 用>25mmol/L的缓冲液;

4.柱污染 每天冲洗柱;

5.柱内条件变化 稳定进样条件,调节流动相;

6.柱快达到寿命 采用保护柱。

(二)保留时间缩短

1.流速增加 检查泵,重新设定流速;

2.样品超载 降低样品量;

3.键合相流失 流动相PH值保持在3~7.5检查柱的方向;

4.流动相组成变化 防止流动相蒸发或沉淀;

5.温度增加 柱恒温。

(三)保留时间延长

1.流速下降 管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡;

2.硅胶柱上活性点变化 用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱;

3.键合相流失 同前(二)3;

4.流动相组成变化 同前(二)4;

5.温度降低 同前(二)5。

(四)出现肩峰或分叉

1.样品体积过大 用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15%;

2.样品溶剂过强 采用较弱的样品溶剂;

3.柱塌陷或形成短路通道 更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件;

4.柱内烧结不锈钢失效 更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品;

5.进样器损坏 更换进样器转子。

(五)鬼峰

1.进样阀残余峰 每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗;

2.样品中未知物 处理样品;

3.柱未平衡 重新平衡柱,用流动相作样品溶剂(尤其是离子对色谱);

4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱)每天新配,用抗氧化剂;

5.水污染(反相)通过变化平衡时间检查水质量,用hplc级的水。

(六) 基线噪声

1.气泡(尖锐峰) 流动相脱气,加柱后背压;

2.污染(随机噪声) 清洗柱,净化样品,用HPLC级试剂;

3.检测器灯连续噪声 更换氘灯;

4.电干扰(偶然噪声) 采用稳压电源,检查干扰的来源(如水浴等);

5.检测器中有气泡 流动相脱气,加柱后背压。

(七)峰拖尾

1.柱超载 降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相;

2.峰干扰 清洁样品,调整流动相;

3.硅羟基作用 加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相PH值,钝化样品;

4.死体积或柱外体积过大 连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管;

5.柱效下降 用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱。

(八)峰展宽

1.进样体积过大 同(四)1;

2.在进样阀中造成峰扩展 进样前后排出气泡以降低扩散;

3.数据系统采样速率太慢 设定速率应是每峰大于10点;

4.检测器时间常数过大 设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10%;

5.流动相粘度过高 增加柱温,采用低粘度流动相;

6.检测池体积过大 用小体积池,卸下热交换器;

7.保留时间过长 等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱;

8.柱外体积过大 将连接管径和连接管长度降至最小;

9.样品过载 进小浓度小体积样品。

作者:青岚 点击:

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